高效液相色譜儀(HPLC)是應(yīng)用高效液相色譜原理，主要用于分析高沸點(diǎn)不易揮發(fā)的、受熱不穩(wěn)定的和分子量大的有機(jī)化合物的儀器設(shè)備。它由儲液器、泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成。儲液器中的流動相被高壓泵打入系統(tǒng)，樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動相，被流動相載入色譜柱(固定相) 內(nèi)，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù)，在兩相中做相對運(yùn)動時，經(jīng)過反復(fù)多次的吸附- 解吸的分配過程，各組分在移動速度上產(chǎn)生較大的差別，被分離成單個組分依次從柱內(nèi)流出，通過檢測器時，樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號傳送到記錄儀，數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來。本文將帶您穿越時空，回顧HPLC的演進(jìn)歷程，剖析當(dāng)前發(fā)展趨勢，并展望未來研究方向，為科研工作者和相關(guān)行業(yè)從業(yè)者提供全面參考。

一、HPLC技術(shù)演進(jìn)之路

高效液相色譜技術(shù)起源于20世紀(jì)40年代的柱色譜法，但真正意義上的現(xiàn)代HPLC系統(tǒng)誕生于60年代末。1966年，第一臺商用HPLC儀器的問世標(biāo)志著分析化學(xué)進(jìn)入全新紀(jì)元。70年代，高壓泵、高效固定相和靈敏檢測器的出現(xiàn)使分離效率大幅提升，分析時間從小時級縮短至分鐘級。

20世紀(jì)80-90年代是HPLC技術(shù)黃金發(fā)展期：自動化控制系統(tǒng)取代手動操作、計算機(jī)數(shù)據(jù)處理軟件普及、色譜柱填料從多孔硅膠發(fā)展到單分散微球材料——這些突破讓HPLC成為制藥、環(huán)境、食品等領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)分析方法。

二、HPLC技術(shù)的發(fā)展趨勢?

1. 超高效，從“個體快速分析”到“適配批量檢測”?

現(xiàn)代分析實(shí)驗(yàn)室里，UHPLC已是基本配置，在有些實(shí)驗(yàn)室里甚至成了主力機(jī)型。亞2 μm填料搭配1500 bar超高壓系統(tǒng)，分析速度提升了5-9倍，靈敏度也高了3倍多。說這些參數(shù)可能沒感覺，但實(shí)際用起來差別太大了。比如，在藥企質(zhì)控中檢測20個片劑樣品，用傳統(tǒng)HPLC方法需要4個小時，而使用UHPLC只要2個小時就能搞定，不用總趕在下班前慌慌張張出報告。環(huán)境監(jiān)測站的同事也說，汛期水樣多的時候，要是還用普通的HPLC，全員加班都未必能趕在時效內(nèi)出結(jié)果，有了UHPLC，效率提上來，大家也能喘口氣?，F(xiàn)在廠商仍在UHPLC的耐用性上發(fā)力研發(fā)，比如延長超高壓下的密封圈壽命，提升柱溫箱的控溫精度等。畢竟對分析工作者來說，“快”雖然好，但“儀器穩(wěn)定少出故障”才是真的省心力。儀器要是總出問題，再快也沒用。?

2. 智能化與聯(lián)用技術(shù)：從“手動調(diào)方法”到“儀器幫著解決問題”?

現(xiàn)在HPLC的“智能”，不是促銷噱頭，而是真能幫著解決實(shí)際問題。就說自動方法開發(fā)，以前開發(fā)一個新樣品的檢測方法，得手動試驗(yàn)流動相比例、柱溫、流速，有時候試十幾次都未必能讓峰分離好，費(fèi)時費(fèi)力費(fèi)試劑?，F(xiàn)在的HPLC智能系統(tǒng)，能根據(jù)樣品性質(zhì)推薦初始條件，根據(jù)初始試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行自動迭代優(yōu)化，小半天就能提供一套可行的方法，尤其適合新藥研發(fā)時篩查雜質(zhì)。還有智能故障診斷，以前儀器報警，得對著手冊一條一條排查，是泵的問題還是檢測器的問題，有時候查半天發(fā)現(xiàn)只是進(jìn)樣閥有氣泡。現(xiàn)在系統(tǒng)直接提示“可能故障點(diǎn)”，還告知解決方法，如“建議沖洗進(jìn)樣閥”、“檢查流動相是否耗盡”等。這樣就算是剛上手的新人，也能快速處理，不用總找老員工幫忙。?

HPLC與質(zhì)譜（LC-MS）、與核磁（LC-NMR）的聯(lián)用也特別實(shí)用。以前分離出未知峰，得再用其他儀器驗(yàn)證，來回折騰；現(xiàn)在利用 LC-MS聯(lián)用，分離完直接就能出分子結(jié)構(gòu)信息，藥企做雜質(zhì)研究時，不用再反復(fù)提純樣品；蛋白質(zhì)組學(xué)研究里，LC-MS 能同步出峰形和結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，復(fù)雜樣品也能高效解決。我去年幫朋友做一個代謝組學(xué)項(xiàng)目，要是擱以前，光驗(yàn)證未知峰就得花一周，現(xiàn)在用 LC-MS 聯(lián)用，用不了兩天就能出結(jié)果，這就是聯(lián)用技術(shù)的好處。?

3. 綠色化學(xué)轉(zhuǎn)型：從“只看數(shù)據(jù)”到“兼顧成本與環(huán)?！?

現(xiàn)在做實(shí)驗(yàn)，“綠色”已經(jīng)不是趕時髦了，是真能幫實(shí)驗(yàn)室省錢、減少麻煩。比如微徑柱，相比傳統(tǒng)4.6mm內(nèi)徑的柱子，有機(jī)溶劑消耗能少一半以上。我們實(shí)驗(yàn)室每天要做幾十針樣品，一年下來，光試劑錢就能省不少，而且有機(jī)溶劑廢液少了，處理成本也低了，實(shí)驗(yàn)室的環(huán)評壓力也小了。還有超臨界流體色譜（SFC），用 CO?做主要流動相，又環(huán)保又能分離一些傳統(tǒng) HPLC 難處理的脂溶性樣品，CO?用完還能回收，不用像有機(jī)溶劑那樣擔(dān)心排放問題。?

生物可降解流動相也挺貼心。以前用磷酸鹽緩沖液，時間長了容易在檢測器里沉積，得定期拆洗，特別麻煩?，F(xiàn)在換成檸檬酸緩沖液，既能滿足檢測需求，又能生物降解，不用總拆洗檢測器。這些改變看著小，卻是我們從“只關(guān)注檢測結(jié)果”到“兼顧運(yùn)營成本與環(huán)?！钡膶?shí)實(shí)在在的轉(zhuǎn)變，符合現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室的管理需求，也讓我們做實(shí)驗(yàn)時更省心。

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表 1：HPLC 技術(shù)發(fā)展關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)概括表

三、前沿突破：新研究進(jìn)展與應(yīng)用拓展?

1、材料創(chuàng)新：平衡“分離效率”與“耐用性”?

現(xiàn)在色譜柱的創(chuàng)新，越來越貼合我們的實(shí)際需求。比如新型核殼色譜柱，外層是多孔殼層，內(nèi)層是實(shí)心核，分離效率能跟亞2 μm填料比，反壓卻低了30%。我們實(shí)驗(yàn)室里的老HPLC系統(tǒng)不用換超高壓泵就能用，不用特意花錢換設(shè)備，這對不想頻繁更新儀器的實(shí)驗(yàn)室來說太友好了。?

手性固定相的突破也幫了不少忙。以前做手性藥物檢測，分離手性異構(gòu)體特別費(fèi)勁，得反復(fù)調(diào)流動相添加劑，有時候還得用手性衍生試劑，步驟多還容易出錯，數(shù)據(jù)重復(fù)性也差?，F(xiàn)在新出的手性固定相，比如環(huán)糊精、蛋白質(zhì)基質(zhì)的，直接就能分離多種手性化合物，重復(fù)性還好，不用再擔(dān)心“這次能分開，下次就不行”的問題。我上個月幫一家藥企做手性雜質(zhì)檢測，用新的手性柱，一次就成功了，要是擱以前，少得試三四次。?

高溫耐受固定相也拓展了方法開發(fā)的空間。以前色譜柱高只能用到60℃，遇上高沸點(diǎn)樣品，只能靠提高流動相比例，峰形還未必好。現(xiàn)在的固定相能耐受到 100℃以上，升高柱溫就能加快分離速度，還能減少有機(jī)溶劑的使用。比如測油脂里的抗氧化劑，以前得用80%的乙腈做流動相，現(xiàn)在把柱溫升到80℃，用60% 的乙腈就能分離得更好，既環(huán)保又省試劑，一舉兩得。?

2、應(yīng)用前沿：突破新興領(lǐng)域難題?

HPLC現(xiàn)在的應(yīng)用范圍，比我們剛?cè)胄袝r廣多了，不少以前“想都不敢想”的領(lǐng)域，現(xiàn)在都能用它解決問題。比如mRNA疫苗分析，疫苗里的mRNA片段大小不一樣，純度控制特別關(guān)鍵。以前沒什么好辦法，現(xiàn)在用二維液相色譜（2D-LC），第一維分離不同大小的片段，第二維再進(jìn)一步純化檢測，能精準(zhǔn)找出雜質(zhì)片段，這對疫苗質(zhì)量控制太重要了。?

細(xì)胞治療產(chǎn)品質(zhì)控也是個難題。產(chǎn)品里的殘留蛋白、核酸片段含量特別低，還容易受細(xì)胞碎片干擾，以前很難測準(zhǔn)?，F(xiàn)在用HPLC結(jié)合免疫親和柱，能特異性捕獲目標(biāo)物質(zhì)，再用高靈敏度檢測器檢出，終于解決了“痕量殘留測不準(zhǔn)”的問題。還有納米藥物表征，以前得用好幾臺儀器測粒徑分布、包封率，又麻煩又容易有誤差；現(xiàn)在用HPLC搭配光散射檢測器，一次就能同時測粒徑和濃度，不用在儀器間來回轉(zhuǎn)移方法，省了不少事。?

AI輔助HPLC也引起人們的興趣，有可能實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞代謝物的單分子水平檢測，分辨率特別高。不過說實(shí)話，我們更關(guān)心的是“能不能落地用”—— 目前這種方法還需要大量實(shí)驗(yàn)室本地數(shù)據(jù)訓(xùn)練模型，通用性還有待提高，但至少讓我們看到了HPLC能往更精準(zhǔn)、更微觀的方向走，以后說不定能解決“臨床活檢樣本這類微量樣品檢測”的難題，這對我們做應(yīng)用研究的人來說，是個挺值得期待的方向。

表 2：當(dāng)代 HPLC 技術(shù)趨勢與未來方向概括表?