高效液相色譜儀（HPLC）操作使用步驟

核心原則： 不同品牌和型號(hào)的 HPLC，操作細(xì)節(jié)會(huì)有點(diǎn)差異，但核心思路和操作邏輯是相通的。記住 “開(kāi)機(jī)先沖洗，關(guān)機(jī)要沖凈” 這條老規(guī)矩，準(zhǔn)沒(méi)錯(cuò)。

一、 分析前的準(zhǔn)備（“兵馬未動(dòng)，糧草先行”）

流動(dòng)相準(zhǔn)備：

溶劑選擇：得用 HPLC 級(jí)或更純的溶劑，不然雜質(zhì)容易干擾，基線也會(huì)亂糟糟。

水的純度：用 18.2 MΩ?cm 的超純水，好現(xiàn)用現(xiàn)制，以免久放的水里滋生微生物損壞色譜柱，影響檢測(cè)。

過(guò)濾：所有流動(dòng)相使用前一定要用 0.45 μm 或 0.22 μm 的濾膜真空抽濾，把小顆粒濾掉，不然堵了系統(tǒng)或色譜柱，麻煩就大了。

脫氣： 流動(dòng)相里的氣泡得除掉，不然泵或檢測(cè)器里冒泡，壓力不穩(wěn)，基線也會(huì)跳。常用的方法有在線脫氣、超聲、氦氣鼓泡、抽濾等。

樣品準(zhǔn)備：

樣品得溶徹底，溶液要清亮，不能有固體顆粒。

建議用和流動(dòng)相初始比例差不多的溶劑溶樣品，不然容易出現(xiàn)溶劑效應(yīng)，峰形會(huì)變丑。

特別提醒： 樣品溶液上機(jī)前，一定要用 0.22 μm 的針頭過(guò)濾器濾一下。

色譜柱檢查：

確認(rèn)所用的色譜柱類型（C18、C8、氨基柱等）與分析方法、樣品性質(zhì)等是否對(duì)得上。

看看柱效卡，色譜柱的柱效和壓力應(yīng)該在能接受的范圍內(nèi)。

檢查實(shí)驗(yàn)室環(huán)境：

廢液瓶得有足夠空間，電源、氣體（需要的話）都得正常。

二、 開(kāi)機(jī)、沖洗與平衡系統(tǒng)（“熱身運(yùn)動(dòng)”）

正確開(kāi)機(jī)順序：

打開(kāi)電腦→開(kāi)儀器電源（讓各模塊通電）→啟動(dòng)工作站軟件。

這么做是為了讓軟件順利識(shí)別并連接各個(gè)模塊，少出岔子。

安裝色譜柱與系統(tǒng)沖洗：

把色譜柱接到流路里，注意色譜柱標(biāo)簽上的箭頭應(yīng)與流動(dòng)相流向一致。

關(guān)鍵步驟： 先用低流速（比如 0.2-0.5 mL/min）開(kāi)泵，用當(dāng)前方法需要的流動(dòng)相比例，慢慢調(diào)到工作時(shí)的流速。這樣能避免高壓沖擊壞色譜柱和系統(tǒng)。

檢查各個(gè)接口有沒(méi)有漏液。

系統(tǒng)平衡：

保持工作流速，讓流動(dòng)相一直沖洗色譜柱和整個(gè)流路，直到：

基線平穩(wěn)： 工作站上的信號(hào)線成一條直線，不漂移、沒(méi)毛刺。

壓力穩(wěn)定： 系統(tǒng)壓力波動(dòng)一般要小于 ±1%。

平衡時(shí)間通常 10-30 分鐘，梯度方法可能得更久。

三、 方法設(shè)置與樣品分析（“核心執(zhí)行”）

創(chuàng)建/調(diào)用方法： 在色譜工作軟件里把參數(shù)設(shè)準(zhǔn)，包括流速、流動(dòng)相比例、柱溫箱溫度、檢測(cè)波長(zhǎng)、運(yùn)行時(shí)間、進(jìn)樣量等。

基線觀察： 確認(rèn)基線穩(wěn)定后，再準(zhǔn)備進(jìn)樣。

進(jìn)樣操作（沒(méi)有進(jìn)樣觸發(fā)分析啟動(dòng)功能的手動(dòng)進(jìn)樣方式）：

用合適的進(jìn)樣針，先用樣品溶液潤(rùn)洗幾次，再吸入比進(jìn)樣量稍多的體積。

把進(jìn)樣閥扳到 “Load” 位置，針完全插進(jìn)進(jìn)樣口，快速把樣品注進(jìn)去，然后拔針。

隨后立即把進(jìn)樣閥扳到 “Inject” 位置，同時(shí)在工作站上點(diǎn) “Start” 開(kāi)始采數(shù)據(jù)。

注意： 動(dòng)作得快、銜接要順，別在 “Load” 和 “Inject” 之間停太久。

四、 關(guān)機(jī)與維護(hù)（善后工作不能馬虎）

系統(tǒng)沖洗（重要的一步！）：

分析結(jié)束后，可千萬(wàn)別直接停泵。

根據(jù)使用的流動(dòng)相的類型，選合適的溶劑把系統(tǒng)徹底沖干凈。

如果用了緩沖鹽： 先用高比例水（比如 90% 水）沖 30-60 分鐘，把鹽分洗掉；再用高比例有機(jī)相（比如 90% 甲醇或乙腈）沖 30-60 分鐘，把水分換掉，免得滋生微生物或析出鹽。

如果沒(méi)?緩沖鹽： 直接用90% 甲醇或乙腈高比例有機(jī)相沖 30 分鐘以上就行。

正確關(guān)機(jī)順序：

停泵→關(guān)檢測(cè)器燈（尤其是 UV 燈，能延長(zhǎng)壽命）→關(guān)工作站軟件→關(guān)儀器電源→后關(guān)電腦。

色譜柱保存：

卸下色譜柱，兩端蓋上塞子，按說(shuō)明書要求存（反相色譜柱一般存純甲醇或乙腈里）。

登記記錄： 填好儀器使用記錄，寫上使用人、樣品、方法、儀器狀態(tài)這些，方便以后查詢。

HPLC 使用常見(jiàn)問(wèn)題（Troubleshooting）及解決方案